His-Tag蛋白纯化磁珠常见问题与解决方案

　更新时间：2025-10-22　点击量：55

　　在分子生物学与蛋白研究领域，His-Tag（组氨酸标签）蛋白纯化因特异性高、操作简便的优势被广泛应用，而His-Tag 蛋白纯化磁珠作为核心工具，更是凭借 “快速分离、低样品损耗、适配微量样品” 的特点，成为科研人员的较好选择。

　　一、磁珠如何 “精准捕捉” His-Tag 蛋白？?

　　His-Tag 蛋白纯化磁珠的核心是金属螯合亲和层析（IMAC）原理，通过磁珠表面固定的金属离子与蛋白标签的特异性结合，实现目标蛋白的分离纯化，具体过程可分为 “结合 - 洗涤 - 洗脱” 三步：

　　1、磁珠表面的金属离子螯合

　　磁珠基质（通常为超顺磁性氧化铁颗粒，外包聚苯乙烯或硅胶）表面修饰有螯合基团（如亚氨基二乙酸 IDA、 nitrilotriacetic acid NTA），这些基团能稳定结合二价金属离子（常用 Ni²⁺、Co²⁺，其中 Ni²⁺亲和力强、适用范围广，Co²⁺特异性更高、非特异性结合少）。

　　2、His-Tag 与金属离子的配位结合?

　　目标蛋白的 His-Tag（通常由 6-10 个连续组氨酸组成）中，组氨酸的咪唑环能与磁珠表面的金属离子形成配位键，使目标蛋白特异性吸附在磁珠表面；而杂蛋白因无 His-Tag 或亲和力极弱，不会与磁珠结合，从而实现初步分离。

　　3、洗涤与洗脱的特异性调控?

　　- 洗涤阶段：通过加入含低浓度咪唑（通常 20-50mM）的洗涤缓冲液，竞争性结合磁珠表面的金属离子，洗脱非特异性吸附的杂蛋白，同时保留目标蛋白（目标蛋白与金属离子的结合力更强，需更高浓度咪唑才能竞争）。

　　- 洗脱阶段：提高缓冲液中咪唑浓度（通常 200-500mM），或调节 pH 值（如 pH 降至 4.0-5.0，破坏组氨酸咪唑环与金属离子的配位键），使目标蛋白从磁珠表面解离，最终得到纯化的 His-Tag 蛋白。
二、常见故障及解决方法

常见问题	可能原因	解决方案
目标蛋白结合率低，上清液中仍有大量目标蛋白	1、磁珠未充分活化，金属离子脱落；	1、更换新磁珠，或用 0.1M NiSO₄溶液重新螯合金属离子；
	2、 His-Tag 被蛋白折叠掩盖；	2、加入变性剂（如 8M 尿素）变性后纯化，或更换更长的 His-Tag（如 10×His）；
	3、裂解缓冲液 pH 不当（非 7.0-8.0）	3、调整缓冲液 pH 至 7.4-7.6
洗脱液中杂蛋白多，纯度低	1、洗涤缓冲液咪唑浓度过低；	1、逐步提升咪唑浓度至 50-80mM，增加洗涤次数；
	2、杂蛋白非特异性结合磁珠基质；	2、洗涤缓冲液中加入 0.1% Tween-20，减少非特异性结合；
	3、磁珠用量过多，吸附过量杂蛋白	3、减少磁珠用量（如 50μL 对应 0.5mg 目标蛋白）
洗脱后蛋白变性、聚集，SDS-PAGE 出现 smear 带	1、洗脱温度过高（>25℃）；	1、全程 4℃操作，洗脱时冰浴；
	2、洗脱缓冲液无保护剂；	2、洗脱缓冲液中加入 10% 甘油或 0.5mM DTT，保护蛋白结构；
	3、咪唑浓度过高（>500mM）	3、降低咪唑浓度至 200-300mM，延长洗脱时间至 10 分钟
磁珠吸附效率下降，重复使用后结合力变弱	1、再生不完整，残留蛋白或咪唑；	1、增加再生缓冲液孵育时间至 10 分钟，多洗 1 次去离子水；
	2、金属离子流失；	2、每次再生后用 0.1M NiSO₄重新螯合金属离子；
	3、磁珠破碎，表面积减少	3、振荡时避免剧烈，弃用破碎的磁珠

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